Fue un encargo del duque Ludovico el Moro, se encuentra en Milán, en el refectorio del convento de Santa María delle Grazie. Leonardo, milanés de adopción desde hacía ya doce años, renunció a la consolidada técnica del fresco y trató de aplicar el color directamente a la pared después de prepararla con dos capas; así consiguió una finura de ejecución que de otro modo hubiera sido imposible. Modificó también la estructura tradicional de la escena. En todos los Cenáculos precedentes la mesa con Cristo y los Apóstoles tenía una pared al fondo, y en la mayoría de los casos, Judas estaba sentado a este lado de la mesa. Leonardo, en cambio, situó las figuras en un único plano, en grupos de tres, y abrió a sus espaldas un profundo fondo en perspectiva. También en las fisonomías y los gestos de los personajes, que tienen una dimensión mayor de la real, Leonardo hizo una elección nada habitual. Eligió como momento más dramático de la narración evangélica la frase: "uno de nosotros me traicionará". Cada Apóstol reaccionará de manera de manera diferente, expresan de ese modo una psicología individual.
En el fondo de la composición, tres grandes aperturas dejan filtrar la luz cálida del atardecer. Un lejano fragmento del paisaje añade luminosidad a la pintura. La pared derecha de la pintura está llena de luz, la de la izquierda está en penumbra.
El techo artesonado subraya el efecto de perspectiva. Recuerda mucho los motivos arquitectónicos que utilizó Bramante en la Iglesia de Santa María delle Grazie; con ello intenta dar coherencia estilística de todo el conjunto.
La reciente restauración del Cenáculo ha hecho más legibles los recuadros alineados a lo largo de las paredes en perspectiva. Hoy es posible reconocer en ellos la imagen de tapices flamencos floreados, colgados de los muros con numerosos clavos.
Sobre la mesa se reconocen los bordados del mantel, la vajilla de peltre, las copas, las jarras con agua y vino, las fuentes con el plata fuerte de la Última Cena: pato a la naranja. Estos detalles descriptivos pintados con minucioso detalle, pueden considerarse un precedente para el nacimiento de la naturaleza muerta.
Judas, el traidor, el único de los Apóstoles que apoya el codo sobre la mesa y se inclina hacia delante, de ese modo, el rostro mira hacia el interior y queda en la sombra. Aprieta en la mano el saquito con los treinta denarios, el precio de la traición. Es empujado por Pedro que blande el cuchillo y se proyecta hacia Cristo como para defenderlo.
Para alcanzar un mayor nivel de comunicación Leonardo detenía a gente por la calle para utilizarlas como modelos creíbles y vivos. Observaba los gestos con los oradores y predicadores. Estudiaba el lenguaje de gestos de los sordomudos.
El índice de Tomás apunta hacia arriba con ademán interrogativo. El gesto permite la fácil identificación del personaje ( el incrédulo Tomás tiene que poner el dedo sobre la herida de Cristo resucitado)
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